科研 | Clin Nutr.：妊娠期糖尿病相关的母乳代谢组变化改变新生儿的生长轨迹（国人佳作）

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编译：微科盟大陈子，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读妊娠期糖尿病(GestationalDiabetes Mellitus，GDM)是妊娠期最常见的代谢紊乱，导致人母乳(Human breastmilk/Breast milk，HBM/BM)代谢谱发生改变，HBM代谢产物与GDM孕妇新生儿生长的关系尚未得到深入研究。本文主要目的是量化正常妊娠和GDM妊娠之间HBM代谢的差异。第二个目的是鉴定产后第一年与新生儿生长相关的代谢产物。本研究，我们招募了在分娩时打算采用纯母乳喂养(BF)的母亲及其新生儿(母婴对) (正常妊娠129例，GDM妊娠98例)。正常妊娠(50例)和GDM妊娠(50例)母亲的HBM样本(初乳、过渡乳和成熟乳)通过液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)进行代谢组学分析。受试者工作特征(ROC)分析揭示了GDM相关的成熟HBM代谢指纹图谱。我们采用Spearman相关分析评价代谢产物与新生儿体重增加(BWG)的相关性，总共在每个HBM样品中共鉴定出620个代谢产物，253个化合物具有相同的变化规律，38个化合物在GDM组和正常组之间具有明显的模式转变。此外，12个、49个和28个代谢物在3种奶型上在两组间存在显著差异。22个代谢产物经特征曲线(Receiveroperating characteristic，ROC)分析证实为GDM患者成熟BM的代谢指纹图谱。10种化合物与新生儿生长呈显著负相关，仅2种不饱和脂类(二十碳三烯酸(FA 20：3)和溶血磷脂酰胆碱(LysoPC ) (22：6))与新生儿BWG呈正相关，GDM与HBM代谢物改变有关，只有少部分化合物与新生儿体重( BW )相关。

论文ID

原名：Gestational diabetes mellitus-associated changes in the breast milk metabolome alters the neonatal growth trajectory译名：妊娠期糖尿病相关的母乳代谢组变化改变新生儿的生长轨迹
期刊：Clinical Nutrition
IF：7.312发表时间：2021.06通讯作者：漆洪波，童超
通讯作者单位：重庆医科大学附属第一医院

实验设计

实验结果

1. 母亲的临床特征
母亲的人口学和临床资料见表1。两组孕前年龄和孕前BMI无差异。此外，教育程度、吸烟状况、胎次、妊娠体重增加、孕龄和分娩方式在两组间没有差异。然而，与正常组的女性相比，GDM组的女性不仅在空腹血糖水平，而且在口服葡萄糖耐量试验(Oral glucosetolerance test，OGTT)后1和2小时血糖水平也显著升高。为了验证所选样本是否能代表整个人群，以及是否由于排除受试者而导致基线不存在潜在偏差，我们还分析了最初招募的227名受试者的人口学特征和临床特征。同样，GDM与正常受试者之间唯一的差异是OGTT结果(补充表S1)，表明所选择的样本代表了所有GDM与正常受试者之间的差异。表1 母亲的人口学和临床特征
2.正常和GDM母亲母乳的代谢组
总共有300份来自GDM组和正常组(初乳、过渡乳和成熟乳)的HBM样本进行了非靶向代谢组学分析。PCA结果显示初乳、过渡乳和成熟乳在GDM组和正常组之间存在显著性差异，而同类型HBM在GDM组和正常组之间具有相似性 (补充图S2 A)。经过峰对齐和缺失值去除后，我们在所有样品中检测到445个电喷雾电离正态(ESIþ)特征和230个电喷雾电离负态(ESI)特征(补充表S2)，总共有620个化合物通过使用自制的数据库被鉴定。我们使用人类代谢组数据库(HMDB，http://www.hmdb.ca/)对已鉴定化合物的进一步分析，除167种羧酸及其衍生物、120种甘油磷脂、104种脂肪酰基、98种有机化合物外，我们还发现了78种化合物，包括酮酸及其衍生物和呋喃，41个核苷酸和12个苯类化合物(补充图S2 B)。 3.正常和GDM母亲HBM代谢组学变化
如上图所示，妊娠期糖尿病的构成不仅在不同时期有所不同，而且在妊娠期糖尿病和正常妇女之间也有所不同。为了探讨这种差异是否是由GDM引起的，我们鉴定了GDM组和正常组从初乳到成熟乳的代谢物表达模式。通过将过渡乳中的丰度除以初乳中的丰度计算出的变化倍数(fold change，FC)被转换为Log2 (FC)，并指定为Log2 (FC1)。同样，Log2 (FC2)表示成熟奶相对于过渡奶的丰度变化。因此，我们将620个检测到的化合物分为9种变化模式(初乳-过渡乳、过渡乳熟乳)：模式1 (未改变)、模式2 (未改变-增加)、模式3 (未改变-减少)、模式4 (增加-未改变)、模式5 (增加-增加)、模式6 (增加-减少)、模式7 (减少-未改变)、模式8 (减少-增加)、模式9 (减少-减少) (附表S3)。图1A描绘了每种模式中前5个差异调节的HBM代谢物。在正常和GDM组中，具有相同变异模式的个体代谢产物是相似的。例如，正常和GDM女性的焦谷氨酸均为模式2，而甲基丁酰肉碱、左戊酰肉碱和2-羟基苯乙胺均为模式3;模式5显示UDP-N-acetyl-D-半乳糖胺、硫胺素和吡哆醛，两组中AsnePro和ProeTyr与模式9相关。然而，我们在GDM母乳中也发现了变异模式显著变化的代谢物。例如，D-(þ)葡萄糖、副黄嘌呤、可可碱和茶碱在正常组由模式8变为模式7，而甘油2-磷酸和甘油3-磷酸在正常组由模式6变为模式4。接下来，我们研究了正常组和GDM组之间不同模式代谢产物的主要模式变化。如图1B所示和补充表S2，总共253种代谢物(包括49种羧酸及衍生物(主要为非必需氨基酸)、17种核苷酸、48种饱和脂类和70种不饱和脂类)在GDM组和正常组之间的变化规律相同，占HBM泌乳期总代谢物的近40%。这表明这些是不受GDM影响的HBM的基本成分。另一方面，两组哺乳期间表现出不同变异模式的代谢物可能是GDM影响的组分。其中，GDM组与对照组在任意两个连续阶段的代谢物变化趋势相反，即在初乳到过渡乳或过渡乳到成熟乳这两个阶段的增减之间的转换应该是显著的。因此，我们重点研究了在模式2和3、2和6、2和9、5和6、6和8、8和9之间表现出变异模式转换的代谢产物，总共发现了38种代谢物。其中，在GDM组中，只有一种代谢产物油酰胺从正常组的模式6转变为模式2，而在GDM组中，有15种化合物，包括7种脂类、3种核苷酸和5种有机酸，从正常组的模式6转变为模式5。其中，包括14个AAs和3个糖在内的22个化合物在正常组中被归类为模式8，在GDM组中被转移为模式9。有趣的是，这些变异模式的转变都发生在过渡奶到成熟奶的过程中。此外，两组中表现出不同模式的代谢产物是HBM在一定哺乳期的特征成分。 图1 GDM和正常母乳代谢物的变异模式发生改变
( A )代谢产物在各模式整体变异方面排名前5( | Log2 ( FC1 )| + | Log2 ( FC2 ) | )。FC1表示化合物在过渡乳中的表达量与其在初乳中的表达量之比，FC2表示化合物在成熟乳中的表达量与其在过渡乳中的表达量之比。当P值为0.05 (未配对Student’s t检验)时，认为趋势不变。当P值< 0.05时，Log2 ( FC ) > 0时呈增加趋势，Log2 ( FC ) < 0时呈减少趋势。变异模式用中间的箭头线条图形表示。提供正常组和GDM组中模式1的化合物数目。( B ) GDM组与正常组代谢产物的模式位移。带粉红色变异模式符号的黑边界矩形网格代表两组中呈现相同模式的代谢物数量。 4. GDM组与正常组代谢产物的差异
此外，我们还研究了GDM和正常HBM在泌乳各阶段的79种鉴别代谢物(图2和补充表S4 )。与正常组相比，GDM组初乳中7种代谢物( 2种脂类、2种AAs和3种有机酸)水平降低，5种代谢物( 1种脂类、2种AAs、1种核苷酸和1种有机酸)水平升高，30种代谢物( 22种甘油磷脂和2种脂肪酸)水平降低，19种化合物( 6种AAs、3种脂肪酸和3种核苷酸)水平升高。在成熟乳中，GDM组有10种代谢物下调，包括3种脂类和6种有机酸；18种代谢物上调，主要是6种脂类、7种有机酸、3种核苷酸和2种维生素。其中这些代谢产物中，4 -吡啶氧是唯一的鉴别代谢产物，与正常组相比，GDM组各阶段HBM中4 -吡啶氧水平均升高，而L -哌啶酸和苹果酸在GDM组初乳和成熟乳中均降低。此外，79种代谢物中，有42种只在过渡性牛奶中不和谐，而19种代谢物只在成熟时有差异。此外，GDM组过渡乳和成熟乳中5种代谢物泛酸、核黄素、吡哆醛、4 -羟基- L -苯甘氨酸和O -琥珀酰- L -高丝氨酸含量均高于正常组。但GDM组中只有LysoPC ( 18：2 )在过渡性乳中表达较低，在成熟乳中表达较高。这些结果表明GDM主要与HBM代谢组脂类、AAs和能量供应营养物质有关。 图2 GDM组与正常组初乳、过渡性乳和成熟乳的代谢差异
( A ) GDM组和正常组代谢物的火山图比较各组代谢物的倍数变化和p值。垂直虚线表示单倍变化，水平线表示p值截止0.05。右上方和左上方象限含有明显上调(红色三角)或下调(蓝色三角)的化合物，与正常组比较，p < 0.05。( B ) Venn图显示GDM组和正常组初乳、过渡乳和成熟乳中检测到的不同代谢物的重叠。灰色箭头所示的盒子中的化合物与重叠部分相对应。化合物名称右侧箭头表示GDM组初乳(蓝箭头)、过渡性乳(红箭头)或成熟乳(绿箭头)中化合物相对于正常组从左到右的变化趋势。红箭：增加，蓝箭：减少。 5. 母乳喂养时间对GDM及正常新生儿生长发育的影响
为明确GDM HBM是否影响新生儿生长，分别在0 d、10 d、42 d和1 y时对新生儿进行人体测量评估。首先，GDM与正常新生儿的大于胎龄(Large forgestational age，LGA)、阿氏评分异常及出生时头围(Headcircumference，HC )发生率相似(附表S5 )。初步招募的227例新生儿，除LGA发生率略有差异外，其余入选对象的代表性进一步得到证实(补充表S6)。然后，绘制新生儿出生后第1年的生长轨迹，表明在上述任何时间点，正常组和GDM组BMI无差异，而GDM子代在1 y时体重(body weight，BW)显著升高，身高(Body length，BL)仅在出生后第10天GDM组显著升高(图3A )。为了更具体的评估，我们分别测定0-10d、10-42d和42d-1y阶段BW、BL和体质指数(body mass index，BMI)的增量。结果显示，GDM组与正常组仅有42 d至1 y的BWG差异(图3B )。在这项研究中，12名正常妇女和9名GDM妇女哺乳了6mo以下的孩子。鉴于BF长度在出生后2年内已报道与新生儿BW呈正相关，故将新生儿按BF≥6 mo分组，进一步分析其生长情况。有趣的是，当母乳喂养时间> 6mo时，GDM婴儿的体重在1岁时显著高于正常婴儿(图3C )，GDM母乳持续BF可能与1岁时体重增长加快有关。进一步考察BF持续时间对42 d ~ 1 y新生儿生长的影响。在此期间，正常新生儿BF的持续时间与BWG无关。然而，与BF > 6 mo组正常婴儿相比，GDM婴儿BWG明显增加(图3D )。BMI和BL在所有组中都有平行增加。图3 新生儿生长曲线和BWG，BL增量和BMI增量从分娩到产后1 y
( A，C )新生儿生长曲线的图式呈现。( B，D ) 0-10d、10-42d、42-365d不同时间点BL和BMI的BWG和增量，n =9-41 /组。* P < 0.05为正常组vs GDM组，# P < 0.05为正常BF > 6mo vs GDMBF > 6mo。BF：母乳喂养。 6. GDM患者成熟母乳的代谢组学指纹图谱
模式转换分析表明，GDM对成熟奶成分的影响可能比初乳和过渡奶更深远，GDM患儿的体重增加只发生在成熟奶期。进一步探索主要与GDM状态相关的HBM化合物。38个代谢物从过渡乳过渡到成熟乳，28个GDM和正常妊娠的成熟乳鉴别代谢物，其中3个重叠代谢物进行ROC曲线分析(补充表S7)。63个代谢物中有22个具有显著的错误发现率(FDR)， AUC在0.60 - 0.70之间，其中核黄素的AUC值最高(图4)。 图4 成熟乳代谢产物的受试者工作特征(ROC)曲线分析与GDM显著相关
用曲线下面积(AUCs)来评价各代谢物的性能。ROC曲线间的差异采用Wilson/Brown检验。 7. GDM中HBM代谢产物与异常新生儿体重增加的相关性
为了确定成熟乳中的代谢物是否与GDM患儿的体重有关，我们将上述63个候选代谢物与出生后42 d - 1 y的BWG进行Spearman相关性分析(补充表S8)。不饱和脂类二十碳三烯酸(FA 20:3)和溶血素(LysoPC 20:6)是唯一与体重增重呈正相关的化合物，而有10个化合物与体增重呈负相关，包括磷酸肌酸、肌酸、d -谷氨酸、N-甲基- D -天冬氨酸、L-丝氨酸、磷酸胆碱、伊豆醇、山梨醇、半乳糖醇和阿糖胞苷(图5)。 图5 成熟乳中代谢物与BWG关系的Spearman分析
BF：母乳喂养，AU，任意单位。

讨论

HBM被广泛认为是新生儿最好的食物，但其成分明显不同的个体。因此，针对BF的一般性建议需要根据具体的健康状况进行调整。泌乳是产后最重要的内分泌因素之一，与妇女围产期营养状况密切相关。越来越多的证据表明代谢异常影响HBM的组成。虽然GDM是最常见的妊娠相关代谢疾病，但其对哺乳期间HBM代谢组的影响尚未完全阐明。在本研究中，我们采集了正常和GDM母亲的初乳、过渡乳和成熟乳样本，研究GDM在整个哺乳过程中对代谢组变异模式的影响，而以往的研究仅在特定阶段对GDM女性的母乳代谢组进行研究。通过LC-MS/MS的应用，我们在HBM中鉴定出了620个代谢物，远远多于之前的报道中使用GC-MS和LC-GC-MS鉴定出的代谢物数量。这一发现使我们能够更彻底地确定HBM的组成。根据不同泌乳期代谢产物富集程度的变化，我们将鉴定出的620个代谢物分为9个变异型。初乳、过渡乳和成熟乳中保持稳定的代谢物可能构成HBM的基本营养成分，而在特定阶段表现出显著变化的代谢物可能是各自类型HBM的独特成分。值得注意的是，变异模式的转变都发生在过渡乳到成熟乳之间，这表明GDM对成熟乳代谢的影响可能比初乳和过渡乳更深远。虽然最终分析使用的样本量相对较小，但在227名初始队列中纳入的100名受试者代表了原始样本。最重要的是，我们的样本亚群中LGA的发病率分别为12%和6%，这与报道的GDM和正常体重的非GDM女性中LGA的发病率分别为13.6%和7.7%非常接近，这是一项包括9835名女性的大规模回顾性研究。因此，选取的样本可以用来研究BF对新生儿生长的影响。为探讨GDM母乳对新生儿生长轨迹的潜在作用，我们在出生后第1年除进行出生时的人体学评估外，还进行了3次儿科随访。令人惊讶的是，令人惊讶的是，我们发现GDM后代在第1年显著比对照组后代重，这是由于从第42天到第1年过度的体重。尽管先前的研究报道GDM与7岁超重的后代有关。然而，我们的工作补充了新的证据，表明GDM可以在1岁时影响后代的生长轨迹。碳水化合物是HBM中最普遍的能量来源，例如，HBM中含有丰富的单糖、糖醇、低聚糖它们占整个牛奶能量的40 % ~ 50 %。我们发现三种单糖(伊豆醇、半乳糖醇和山梨醇)与新生儿BWG呈负相关。半乳糖和葡萄糖的产物半乳糖醇和山梨醇分别参与糖酵解，为婴儿生长提供能量。此外，HMO还可作为益生菌、双歧抗黏附因子、抗菌因子和免疫调节因子发挥作用。在这方面，我们建议GDM婴儿补充HMOs和配方中的单糖。此外，脂类是促进婴儿生长的母乳中第二丰富的成分。我们发现两种不饱和脂类，二十碳三烯酸(FA 20:3)和溶血酸(LysoPC, 22:6)与体重增重呈正相关。磷酸胆碱与体重呈负相关。磷胆碱可转化为磷脂酰胆碱产生溶血素，是氧化损伤低密度脂蛋白(oxLDL)的主要成分。此外，我们从饲料中可获得二十碳三烯酸(FA 20:3)和溶菌素，可诱导淋巴细胞和巨噬细胞迁移，增加促炎细胞因子的产生，诱导氧化应激，促进细胞凋亡，促进疾病的发展。此外，LPC可通过上调GLUT4的表达促进脂肪细胞对葡萄糖的摄取，导致糖尿病模型小鼠血糖下降。总的来说，牛奶中适量的脂肪可以促进婴儿生长，但是过多的脂肪可能与新生儿过度生长有关。HBM中的AAs是新生儿蛋白质合成积木的关键来源。在本研究中，N -甲基- D -天冬氨酸、L -丝氨酸和D -谷氨酸三种AAs与BWG呈负相关。虽然这些AAs传统上被归类为非必需AAs，但它们在直接调控关键代谢途径中发挥重要作用。此外，这些AAs与三羧酸循环有关，促进ATP产生，调节基因表达、细胞信号转导、抗氧化反应和免疫。此外，谷氨酸和天冬氨酸是小肠代谢燃料的主要来源，它们和甘氨酸一起调节神经功能。肌酸有助于代谢能量在细胞内的短暂存储，并增加肌肉质量；而磷酸肌酸(肌酸的磷酸化形式，为肌肉和大脑储存能量)也与体重增重呈负相关。因此，我们推测应在GDM新生儿配方中增加上述的AAs和肌酸。然而，本研究有一定局限性。首先，我们没有检测到牛奶的成分，如外泌体、激素和细菌。第二，参数如婴儿肥胖，总脂肪质量，总瘦肉质量和中心性肥胖在本研究中没有评估。第三，母体血清与HBM代谢产物之间的相关性有待进一步研究。最后，在进行Spearman相关分析时，我们未考虑母亲糖耐量受损严重程度的混杂因素。

结论

综上所述，HBM的组成在哺乳期发生了变化，GDM中这种代谢组学变化受到干扰。GDM母乳喂养婴儿42 d至1 y时BWG过量，可能是由于GDM母乳中二十碳三烯酸( FA 20∶3 )和溶血磷脂酸( lysoPC 22∶6 )水平较高，3种单糖(伊豆醇、半乳糖醇、山梨醇)和3种AA ( N-甲基-达斯巴酸、L-丝氨酸、D-谷氨酸)缺乏所致。尽管这些代谢物对儿童生长的影响需要进一步明确，但本研究建议，为防止过度生长，应仔细为GDM后代量身计划哺乳期，并针对GDM后代修改婴儿配方奶粉，使其获得最佳喂养结果。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33640207/

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